利用大腸桿菌檢驗(yàn)離心機(jī)的檢測(cè)方法

發(fā)布時(shí)間：

2014-01-24

概要：

臨床分離大腸桿菌菌株(南方醫(yī)院檢驗(yàn)科)。盧湘儀大腸桿菌檢驗(yàn)離心機(jī)；UV-265紫外分光光度計(jì)、搖床恒溫水浴箱、震蕩器、滅菌大試管、毛細(xì)管、玻片、注射器管。

　　微生物學(xué)中細(xì)菌的檢驗(yàn)往往需要一周時(shí)間，其結(jié)果對(duì)臨床和藥品生產(chǎn)已無太大意義，尤其在藥品半成品檢驗(yàn)中更不能適應(yīng)藥品生產(chǎn)的要求。雖有改進(jìn)方法的報(bào)道，但仍脫離不了傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法，且專屬性、靈敏度差?，F(xiàn)根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理及實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，試用大腸桿菌抗血清檢測(cè)大腸桿菌抗原獲得成功。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　設(shè)備與材料

　　健康新西蘭大耳白家兔(第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。大腸桿菌(44102-15，衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)；臨床分離大腸桿菌菌株(南方醫(yī)院檢驗(yàn)科)。UV-265紫外分光光度計(jì)；搖床恒溫水浴箱、盧湘儀大腸桿菌檢驗(yàn)離心機(jī)、震蕩器、滅菌大試管、毛細(xì)管、玻片、注射器管。0.5%石炭酸溶液、硫柳汞溶液、飽和硫酸胺溶液、磷酸鹽緩沖液、鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液等。實(shí)驗(yàn)用材料均需滅菌處理。

1.2　方法與結(jié)果

1.2.1　大腸桿菌抗原的制備　取5 ml石炭酸生理鹽水，注入經(jīng)24 h培養(yǎng)的大腸桿菌斜面，洗下菌苔并移至無菌三角錐瓶中，于60℃搖床恒溫水浴箱中放置4 h，取出，搖勻。比濁法、平皿法同時(shí)計(jì)數(shù)，用石炭酸生理鹽水稀釋至9×109個(gè)/ml再放入60℃水浴箱中1～1.5 h，取少許做無菌實(shí)驗(yàn)，其余菌懸液放冰箱保存。

1.2.2　大腸桿菌抗血清的制備　取無菌檢查合格的菌懸液，按表1所示［1］，經(jīng)兔耳靜脈注射，并按表2經(jīng)兔耳靜脈取血清1 ml，利用盧湘儀大腸桿菌檢驗(yàn)離心機(jī)進(jìn)行分離，用玻片法測(cè)定效價(jià)，結(jié)果第14日效價(jià)最高為1∶5120，經(jīng)兔動(dòng)脈取第14日血［2］制成最大斜面，冰箱中過夜，收集血清，加硫柳汞液約2.5 ml/30 ml血清。

表1　大腸桿菌抗原注射劑量時(shí)間表

Table 1　Schedule of injection time and dosage of Antigen of E.C.bacilus

Time Dosage (ml) Avoirdupois of rabbit (kg)

One day 0.2 1.8

Two day 0.4 2.0

Four day 0.6 1.9

Six day 2.0 2.0

1.2.3　抗血清保存實(shí)驗(yàn)　取大腸桿菌抗血清原液及稀釋液置冰箱中，于不同時(shí)間測(cè)定效價(jià)，結(jié)果抗血清至少可保存50 d(表2)。

表2　保存時(shí)間實(shí)驗(yàn)

Table 2　Test of time antiserum kept

Efficiency of

antiserum Firmly extent

10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d

1∶5120 +++ +++ +++ +++ +++ +++

1∶2560 +++ +++ +++ +++ +++ +++

1∶1280 +++ +++ +++ +++ +++ +++

1∶640 +++ +++ +++ +++ ++ ++

1∶320 +++ +++ ++ ++ + -

+++、++表示玻片法、試管法均形成牢固凝膠；+表示玻片法凝膠牢固，試管法不牢固；-表示玻片法、試管法均不凝固

1.2.4　混合抗血清的制備　取大腸桿菌(44105-15)與臨床、藥物分離菌株制備混合抗原和混合抗血清，結(jié)果混合抗血清的效價(jià)為1∶4 800。

1.3　大腸桿菌原檢測(cè)

1.3.1　檢測(cè)已知抗原　取大楊桿菌(44102-15)1株，臨床分離菌株5株，藥物分離菌株4株及藥物污染大腸桿菌(44102-15)后分離菌株5例，用玻片法以1∶320效價(jià)的抗血清檢測(cè)，結(jié)果全部陽(yáng)性(陽(yáng)性、陰性對(duì)照均成立，陰性用滅活的葡萄球菌，沙門氏菌)。